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前 言

本技術(shù)規(guī)范按照GB/T 1.1-2009的規(guī)則起草。
本技術(shù)規(guī)范由重慶法醫(yī)驗(yàn)傷所提出。
本技術(shù)規(guī)范由司法部鑒定管理局歸口。
本技術(shù)規(guī)范起草單位： 重慶法醫(yī)驗(yàn)傷所。
本技術(shù)規(guī)范主要起草人： 丁世家，李劍波，趙華，靳紅衛(wèi)，李永國(guó)，劉德偉。
本技術(shù)規(guī)范為首次發(fā)布。

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定硫化氫中毒血液中的硫化物實(shí)施規(guī)范

1 范圍
本技術(shù)規(guī)范規(guī)定了氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定硫化氫中毒血液中硫化物的方法。
本技術(shù)規(guī)范適用于硫化氫中毒血液中硫化物的定性及定量分析。

2 規(guī)范性引用文件
下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。
凡是不注日期的引用文件，其新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。
GB/T 6682 分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法

3 檢測(cè)范圍與檢出限
硫化氫中毒血液中硫化物測(cè)定方法的檢測(cè)范圍為0.05~10.0 mmol/L,其檢出限為0.007 mmol/L。

4 原理
硫化氫中毒血液中的多種形態(tài)硫化物在堿性條件下轉(zhuǎn)化成硫離子，經(jīng)衍生化后采用液-液萃取法提取衍生物，并用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行檢測(cè)；經(jīng)與硫化鈉對(duì)照品比較，以保留時(shí)間、特征離子進(jìn)行定性分析，用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量分析。硫化氫衍生物的質(zhì)譜圖與色譜圖參見(jiàn)附錄A。

5 實(shí)用檢材
硫化氫中毒實(shí)用檢材一般須迅速采集新鮮的血液，并注意密封冷凍保存和及時(shí)檢驗(yàn)，防止檢材腐敗產(chǎn)生硫化氫而引起干擾。

6 試劑和材料
除另有規(guī)定外，試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水。 需要的試劑和材料如下：

a) 硫化鈉：分析純，含量 99%以上；
b) 硫化鈉標(biāo)準(zhǔn)系列工作液：精密稱取對(duì)照品硫化鈉適量，用一級(jí)水配成 20.0 mmol/L 的硫化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液（儲(chǔ)備液），將儲(chǔ)備液用一級(jí)水稀釋成濃度為 0.5 mmol/L、 1.0 mmol/L、 2.0 mmol/L、5.0 mmol/L 和 10.0 mmol/L 的硫化鈉標(biāo)準(zhǔn)系列工作液；
c) 五氟芐基溴：用甲苯配制成 20.0 mmol/L 的溶液；
d) 1,3,5-三溴苯(TBB)：用乙酸乙酯配制成 0.01mmol/L 的溶液；
e) 苯扎氯銨；
f) 四硼酸鈉；
g) 磷酸二氫鉀；
h) 乙酸乙酯；
i) 甲苯。

7 儀器
需要的儀器如下：
a) 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：配有電子轟擊離子源(EI)；
b) 分析天平：感量 0.1 mg；
c) 漩渦振蕩器；
d) 低溫離心機(jī)；
e) 精密移液器；
f) 可控溫?fù)u床。

8 測(cè)定步驟
8.1 樣品處理
取血液0.4mL于具塞離心管中，加入1.5 mL 5.0 mmol/L苯扎氯銨的 0.04 mol/L四硼酸鈉溶液，然后加入20.0 mmol/L五氟芐基溴甲苯溶液1.0mL、 0.01 mmol/L TBB乙酸乙酯溶液1.0 mL，加蓋密封，于振蕩器中渦旋振蕩1 min，置于55℃恒溫?fù)u床中振搖4h, 加入0.1 g的磷酸二氫鉀，振蕩器中渦旋振蕩1min，于轉(zhuǎn)速4000 r/min離心5 min,分離有機(jī)層，取樣1.0 L進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析。 五氟芐基溴與中毒血液中硫離子發(fā)生的衍生化反應(yīng)參見(jiàn)附錄B。
8.2 測(cè)定
8.2.1 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀測(cè)定參考條件
氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀測(cè)定參考條件如下：
a) 色譜柱：推薦使用 HP-5MS 30 m×0.25 mm×0.25 μm高效毛細(xì)管色譜柱；也可以使用 Rtx-5MS,Rtx-5 Amine, DB-5MS, PTE-5 等色譜柱；
b) 柱溫：初始溫度 50 ℃，保持 1 min，以 10 ℃/min 升到 280 ℃，保持 1 min；
c) 進(jìn)樣口溫度： 200 ℃；
d) 傳輸線溫度： 240 ℃；
e) 載氣：氦氣，純度≥99.9999%，流速 1.0mL/min；
f) 分流比： 10:1；
g) 進(jìn)樣量： 1.0 μL；
h) 離子源：電子轟擊離子源；
i) 檢測(cè)方式：選擇離子檢測(cè)掃描，硫化物衍生物的特征離子為 m/z 394, m/z 181, m/z 45;內(nèi)標(biāo) TBB 的特征離子為 m/z 312, m/z 233,m/z 154。
8.2.2 定性測(cè)定
將空白檢材、空白添加（ Na2S）檢材和樣品檢材按照8.1處理后，在相同色譜條件下進(jìn)行GC/MS分析，分別以空白添加檢材總離子流圖中內(nèi)標(biāo)和硫化物衍生物的保留時(shí)間和保留時(shí)間對(duì)應(yīng)的特征離子峰作為參照，對(duì)樣品檢材進(jìn)行定性分析，以空白檢材進(jìn)行方法的專屬性測(cè)定。硫化氫中毒血液中硫化物的GC/MS分析參數(shù)參見(jiàn)附錄C。
8.2.3 定量測(cè)定
8.2.3.1 精密度與檢出限
定量測(cè)定采用內(nèi)標(biāo)法-單點(diǎn)校正法或內(nèi)標(biāo)法-標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量測(cè)定。該方法精密度： CV＜10%；檢出限：可檢出 0.007 mmol/L的硫化物。
8.2.3.2 內(nèi)標(biāo)法-單點(diǎn)校正法
在空白血液中添加相近濃度的對(duì)照品，和檢材按照以上步驟同時(shí)進(jìn)行定量測(cè)定。檢材濃度應(yīng)在添加對(duì)照品濃度的±50%以內(nèi)。
8.2.3.3 內(nèi)標(biāo)法-校準(zhǔn)曲線法
在空白血液中添加適量硫化鈉對(duì)照品制得一系列校準(zhǔn)樣品，以硫化鈉衍生化物與內(nèi)標(biāo)峰面積比對(duì)硫化鈉濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，用標(biāo)準(zhǔn)曲線法對(duì)檢材進(jìn)行定量，并且保證所測(cè)樣品中硫化物的濃度值在其線性范圍內(nèi)。
8.3 平行試驗(yàn)
8.3.1 按以上步驟對(duì)同一試樣進(jìn)行平行試驗(yàn)。
8.3.2 平行試驗(yàn)中兩份檢材測(cè)定結(jié)果按兩份檢材的平均值計(jì)算，雙樣相對(duì)相差不得超過(guò) 20%。
8.3.3 雙樣相對(duì)相差 d 按照式（ 1）及式（ 2） 計(jì)算：

式中：
C1、 C2——兩份樣品平行定量測(cè)定的結(jié)果。
8.4 空白試驗(yàn)
除以相同基質(zhì)空白替代檢材外，均按上述步驟進(jìn)行。

9 結(jié)果計(jì)算
以內(nèi)標(biāo)-校準(zhǔn)曲線法或按式(3)計(jì)算被測(cè)樣品中硫化物的濃度：

式中：
C——血液樣品中目標(biāo)物的濃度，單位為毫摩爾每升(mmol/L)；
A——血液樣品中目標(biāo)物的峰面積；
A′ ——標(biāo)準(zhǔn)溶液中目標(biāo)物的峰面積；
SF/Z JD0107013-2014
Ai′ ——標(biāo)準(zhǔn)溶液中內(nèi)標(biāo)物的峰面積；
Ai——血液樣品中內(nèi)標(biāo)物的峰面積；
C——標(biāo)準(zhǔn)溶液中目標(biāo)物的濃度，單位為毫摩爾每升(mmol/L)。
SF/Z JD0107013-2014

附 錄 A
（資料性附錄）
硫化氫衍生物的質(zhì)譜圖與色譜圖

硫化氫衍生物的質(zhì)譜圖見(jiàn)圖A.1。

圖A.1 硫化氫衍生物的質(zhì)譜圖

硫化氫衍生物的的色譜圖見(jiàn)圖A.2。

說(shuō)明：
A： TBB（內(nèi)標(biāo)），保留時(shí)間為12.5 min；
B：硫化氫中毒血中的硫化氫，保留時(shí)間為15.0 min。
圖A.2 硫化氫衍生物的色譜圖

附 錄 B
（資料性附錄）
五氟芐基溴與中毒血液中硫離子發(fā)生的衍生化反應(yīng)

五氟芐基溴與中毒血液中硫離子發(fā)生的衍生化反應(yīng)見(jiàn)圖B.1。

附 錄 C
（資料性附錄）
硫化氫中毒血液中硫化物的 GC/MS 分析參數(shù)

硫化氫中毒血液中硫化物的GC/MS分析參數(shù)見(jiàn)表C.1。
圖C.1 硫化氫中毒血液中硫化物的 GC/MS 分析參數(shù)